摘要：目的采用UPLC建立丹参微波提取法与传统提取法的指纹图谱并鉴定主要色谱峰，结合化学计量学方法比较不同提取方法化学成分的特征差异。方法采用超高效液相色谱，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相，体积流量为0.3mL/min，检测波长为nm，建立丹参传统提取法与微波提取法的指纹图谱；对8个指标性成分进行含量测定，采用SPSS22.0软件进行主成分分析和t检验分析，从而进一步评价丹参微波提取与传统提取法之间的差异性。结果传统提取法与微波提取法分别标定16个共有峰和17个共有峰，且8个指标性成分的含量具有差异性。在相似度评价中，对丹参不同提取法的指纹图谱进行对比，相似度均＞0.。指标性成分的含量上，微波提取法中指标性成分的综合质量分数均高于传统提取法，8个指标成分的均值表明微波提取法高于传统提取法，与传统提取法比，丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮IIA的含量具有显著性差异（P＜0.05，0.01）。结论通过对指纹图谱的比较，以及化学计量学方法评价，丹参不同提取法下的整体化学组分类似，通过t检验分析化学成分的含量具有一定差异，且丹参微波提取法的含量高于传统提取法。微波提取法相较于传统提取法具有一定的优势，此方法的建立可以为微波提取法在中药领域的广泛应用奠定基础。
中药所含成分复杂，中药有效成分的提取对阐明传统中药作用机制、开发新药等具有重要意义，传统提取法的加热原理是由外部热源通过热辐射由表及里的传导方式加热[1]，但存在提取率低、杂质含量高、耗时长等缺点[2]。近年来，许多高新技术被应用于中药有效成分的提取，如微波辅助提取技术、酶法提取技术、膜提取分离技术、分子印迹技术等[3]，其中微波提取技术原理是基于微波通过离子传导或偶极子旋转对分子的直接影响，分子水平的运动和分子间的摩擦使电磁波的能量转化为热能，提高基体的温度，这种作用导致细胞破裂，有利于化合物的提取。它可以减少溶剂用量、时间、温度和能源消耗，具有有效的细胞壁破坏能力[4]，从而更好地对化合物进行提取和分离。此外，微波辐射加热具有一定程度的灭菌效果，能够满足医疗卫生要求[5]。微波提取已广泛应用于食品、工业等各个领域，相比于传统提取方法，微波提取法（MAE）具有显著的优点，能大大节约反应时间，所得目标物的提取率相对较高[6]。基于课题组前期研究的基础[2]，本研究选取复方丹参片中丹参为研究对象[7]，建立了丹参传统提取与微波提取方法的指纹图谱，分析了11批药材不同提取方法指纹图谱的异同，进一步指认了丹参不同提取方法共有峰的成分并对其进行定量和差异性分析，为微波提取方法在中药领域的可持续发展奠定基础，为新技术的开发提供参考依据。
1仪器与试药
Agilent型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，DAD型检测器）；A型分析天平（上海良平仪表有限公司）；AE型电子天平[梅特勒托利多仪器（上海）有限公司]；SKHP型超声波清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-4型数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；OPWO8S型澳润微波提取器（南京澳润微波科技有限公司）。
对照品丹参素钠（批号-）、原儿茶醛（批号-）、丹酚酸B（批号-）、隐丹参酮（批号-）；丹参酮IIA（批号-）均购于中国食品药品检定研究院，质量分数均大于95%；紫草酸（批号-65-4，贵州迪大生物科技有限责任公司）、丹参酮I（批号，江西佰草源生物科技有限公司）质量分数＞98%；甲醇、乙腈均为色谱纯（美国Tedia公司）；屈臣氏水（深圳屈臣氏蒸馏水有限公司）。11批丹参样品信息见表1。经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为唇形科鼠尾草属植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，并将其编号为SC1～SC11（传统提取法[7]）、SW1～SW11（微波提取法[7]）。
2方法与结果
2.1色谱条件
WatersACQUITYUPLCBEHsheidC18（mm×2.1mm，1.7μm）色谱柱；柱温25℃；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～3min，7%～10%A；3～5min，10%～16%A；5～25min，16%～30%A；25～38min，30%～54%A；38～51min，54%A；51～55min，54%～7%A；体积流量0.3mL/min；进样量1μL；检测波长nm。
2.2对照品溶液制备
分别精密称取丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA对照品适量，用甲醇配成质量浓度分别为.0、.0、.0、.0、.0、.0、.0、.0μg/mL的混合对照品溶液。
2.3供试品溶液制备
称取丹参适量，用10倍量95%乙醇加热回流1.5h，提取液滤过备用；药渣加10倍量50%乙醇回流1.5h，滤过备用；最后用10倍量水回流2h，合并滤液并定容至mL，再取4mL定容至5mL量瓶，取溶液r/min离心10min，取上清液适量，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。以上加热方式分别采用水浴加热和微波加热制得传统提取法供试品和微波提取法供试品。
2.4方法学考察
2.4.1精密度试验取SC1号样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图。以丹酚酸B峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于2.59%，表明仪器精密度良好。
2.4.2重复性试验取SC1号样品6份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别检测，以丹酚酸B峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于2.59%，表明方法重复性良好。
2.4.3稳定性试验取SC1号样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样检测色谱图。以丹酚酸B峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于1.63%，结果表明供试品溶液在24h内稳定。
2.5指纹图谱建立及相似度分析
2.5.1丹参不同提取法UPLC指纹图谱共有模式的建立取不同批次的丹参药材，精密称定，分别按照供试品溶液的制备及检测方法进行检测，将11批丹参传统提取方法的图谱（SC1～SC11）与微波提取方法的图谱（SW1～SW11）以AIA格式导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（国家药典委员会4A版），分别以SC1号样品和SW1的图谱为参照谱，设定时间窗宽度为0.1，采用中位数法自动匹配生成不同提取方法的丹参指纹图谱共有模式（即对照图谱），计算SC1～SC11和SW1～SW11样品特征图谱的相似度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.和0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.。11个批次的药材采用不同提取方法，相似度均大于0.，表明各产地的药材具有较好的一致性，为评价不同提取法奠定基础。
2.5.2丹参传统提取与微波提取方法指纹图谱比较将11批丹参样品不同提取方法UPLC指纹图谱依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统4A版》软件进行数据分析处理，以传统提取方法的SC1图谱为参照谱，计算11批丹参药材微波提取法与传统提取法指纹图谱的相似度，结果见表2，微波提取与传统提取指纹图谱的相似度均大于0.，表明丹参不同提取法下的整体化学组分类似，但化学成分存在一定差异，相似度最低的是SW11与SW8样品。
2.5.3主成分分析（PCA）采用SPSS20.0对11批丹参不同提取方法的共有峰进行PCA，结果得到累积方差＞85%的只有1个成分，PC1的累积贡献率为98.29%，贡献率最大，包含了更多的信息。即使成分1累积方差能达85%以上，在计算时也要将提取因子设置为“2”。所以采用PC1、PC2建立坐标系进行投影，得到11批丹参不同提取方法PCA得分图，见图1。从图中可以看出，除SW11和SW8离其他样品的投影点距离较远，其余批次样品均相隔较近，表明除SW11和SW8样品与其他样品有差异外，其余样品均无差异，此结果和相似度分析结果相一致。
2.5.4共有峰的指认对丹参不同提取方法共有峰的图谱进行指认，与对照品比对后确定了其中8个成分，分别为丹参素钠（1号峰）、原儿茶醛（2号峰）、迷迭香酸（5号峰）、紫草酸（8号峰）、丹酚酸B（9号峰）、隐丹参酮（12号峰）、丹参酮I（15号峰）、丹参酮IIA（17号峰），如图2所示。
2.6定量分析方法与结果
2.6.1系统适应性试验按照“2.1”项下的色谱条件进行检测，8种成分（丹参素钠、儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA）分离度均大于1.5，混合对照品溶液色谱图，丹参传统提取、微波提取的对照图谱如图3所示。
2.6.2线性关系取“2.2”项下对照品溶液依次稀释到不同质量浓度，每个质量浓度对照品溶液进样1μL，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），进样质量浓度为横坐标（X），进行线性回归，即得回归方程及线性范围，见表3。
2.6.3精密度试验取SC1号样品的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的RSD分别为0.41%、0.98%、0.85%、0.33%、0.32%、0.27%、1.42%、0.55%，表明仪器精密度良好。
2.6.4稳定性试验取SC1号样品的供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样并记录峰面积，计算丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的RSD分别为0.84%、0.82%、0.85%、0.87%、0.70%、0.63%、1.43%、2.96%，表明本方法的稳定性良好。
2.6.5重复性试验取SC1号样品，按照“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积并计算丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮丹参酮I、丹参酮IIA的RSD值分别为0.64%、0.42%、0.85%、0.61%、0.35%、0.37%、2.%、1.94%，表明本方法的重复性良好。
2.6.6加样回收率试验精密量取已测定量的SC1号样品提取液2mL，6份，加入混合对照品适量，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积并计算回收率。结果表明丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA的平均回收率分别为98.61%、.20%、.80%、.30%、.60%、96.87%、98.26%、99.18%，RSD分别为1.49%、0.88%、0.93%、0.72%、0.52%、0.97%、2.06%、0.72%，均小于2%，符合《中国药典》年版的规定，表明回收良好，方法可靠。
2.6.7样品测定精密称取丹参药材，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下测定，根据回归方程计算各成分含量，结果见表4。由表4可知，各个批次丹参微波提取法中8个成分均高于传统提取法。丹参微波提取中指标性成分总质量分数明显高于传统提取法。从指标性成分的均值上也明显地看出，丹参微波提取法的含量高于传统提取法。进一步采用SPSS软件对8个指标性成分进行t检验，与传统提取法相比，化合物丹参素钠、原儿茶醛、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA具有极显著性差异（P＜0.01），迷迭香酸具有显著性差异（P＜0.05）。
3讨论
3.1色谱条件的优化
本实验分别考察了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.01%磷酸水、乙腈-0.1%乙酸水作为流动相，结果表明，选用乙腈-0.1%甲酸水时，峰形及分离度最好。在上述的条件下进行全波长扫描，在nm波长下，色谱图噪音较少，响应值较好。分别对25、30、35℃的柱温进行考察，选用25℃的柱温时，色谱峰的峰形较好，柱压相对较小。分别对1、1.5、2μL3个进样体积进行考察，选用1μL的进样体积时丹参酸B不会产生平头峰，不超过检测限。最终确定的色谱条件是采用WatersACQUITYUPLCBEHsheidC18（mm×2.1mm，1.7μm）色谱柱，流动相为乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A），柱温25℃，进样量1μL，检测波长nm，体积流量0.3mL/min。
3.2丹参传统提取与微波提取相似度的评价
指纹图谱具有“模糊性”和“整体性”，可以更加直观地了解所分析物质所含的成分[10-11]。本实验采用不同的提取方法对11批丹参药材进行提取，建立了相应的指纹图谱并对其相似度进行分析。结果丹参在化学成分的种类、数量上无明显差异。即使采购于不同地区，2种提取工艺的相似度均达到0.以上，说明丹参药材的整体差异很小，药材批次之间的化学组分基本相似，质量相对稳定。最后对传统提取和微波提取的指纹图谱进行对比，丹参微波提取与传统提取指纹图谱的相似度均大于0.，说明微波提取法对丹参的化学组分影响较小。进一步采用PCA法[12-15]对其结果进行分析，结果和相似度的结果一致，SW11和SW8样品与其他样品间有一定差异，这是由药材本身质量决定的。
3.3含量分析
本实验采用UPLC测定丹参微波提取与传统提取中丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA8个成分的含量，22个样品进行比较，除了SW2、SW3及SW8样品中丹参酮I成分外，其余的含量均比传统提取法的高，但含量之间的差异很小。从总质量分数的结果可以看出微波提取法均大于传统提取法。丹参的化学成分主要包括丹参酮类的脂溶性成分和酚酸类的水溶性成分[16]，本实验中指标性成分既有水溶性又有脂溶性成分，而最终微波提取法中总质量分数均高于传统提取法，所以微波提取法对脂溶性成分和水溶性均具有较好的提取效果。采用t检验进行分析，结果表明微波提取法与传统提取法具有差异性。结合含量的结果综合分析，微波提取法优于传统提取法。
本实验首先建立并比较丹参不同提取法的指纹图谱，指认了2种提取法共有的8个化学成分，定性分析的结果证明了丹参不同提取法整体化学组分的相似性。由定量结果可知，不同提取法对丹参含量上具有差异性。本实验先采用定性分析不同提取法之间的相似性，其次再分析不同提取法之间的差异性，综合评价不同提取法之间的差异性。在实验过程中，使微波提取时间、温度、溶剂类型和液固比与传统提取法保持一致，评价2种不同加热方式的提取法对丹参化学成分的影响，最终得出不同提取法对丹参化学成分有显著性差异且微波提取法的含量高于传统提取法。微波在加热过程中遇到不同介质会发生反射、吸收和穿透的现象，对于极性溶剂则具有吸收的作用即本实验采用的是水和不同比例的乙醇。本实验采用了常压微波提取法中的固定溶剂提取方法，使提取时压力和溶剂流动性与传统提取法保持一致，从而更好地评价微波提取法与传统提取法之间的差异性。微波提取法属于绿色工程，并且符合环境保护的要求。该方法已广泛应用于各个领域，对于有机金属的污染[8]、化妆品[9]中的残留等都采用微波提取法。本实验阐述了微波提取法对丹参化学成分无明显的变化，从而为微波中药微波提取技术的工业化实现提供理论依据，将对提高中药制造业的现代化水平具有重要的推动作用。
参考文献（略）
来源：徐雪，徐剑，张永萍，缪艳燕，刘耀，周雪娇.基于指纹图谱结合化学计量法评价丹参微波提取与传统提取法的差异性[J].中草药,,50(17):-.
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