摘要：目的在质量源于设计（qualitybydesign，QbD）理念的指导下优化丹参川芎嗪注射液（SalviaeMiltiorrhizaeandLigustrazineHydrochlorideInjection，SMLHI）的水提工艺。方法首先通过筛选实验设计确定加热温度、保温时间、药材规格和溶剂倍量为丹参水提工艺的关键工艺参数。随后为了提高实验效率，采用基于裂区的D-最优实验设计优化SMLHI的水提工艺。为了尽可能多的提取实验数据潜在信息，采用了响应曲面法和人工神经网络法2种方法建立关键工艺参数和关键质量属性之间的回归模型。最后，选择较优的模型进一步采用基于满意度函数的多指标优化算法综合考察提取液各关键质量属性，确定水提工艺的最佳操作条件。结果基于裂区的D-最优实验设计可以有效提高实验效率，同时发现人工神经网络模型较响应曲面法模型具有更好的拟合能力和预测能力。以人工神经网络模型为基础进行多指标优化，最终确定SMLHI水提工艺的最佳操作条件为加热温度℃，保温时间84min，药材规格11cm，溶剂用量为10倍。结论利用基于裂区的D-最优实验设计法优化了SMLHI水提工艺，为传统的中药制药工艺研究过程中面临的工艺参数改动受限、更改成本高昂的情况提供合理的实验设计方案，提高研究效率，降低研究成本，对不同试验规模下中药制药工艺的过程研究具有较大参考价值，为中药的工艺二次开发提供了可供参考的新方法。
在中药大品种二次开发中，一般需要采用实验设计方法优化制备工艺参数[1-4]。但在实验过程中，可能面临某些难以改变的工艺参数、满足不了设计的完全随机化要求的困难。为了提高实验效率，需要引入裂区实验设计（split-plotexperimentdesign）方法[5-6]。与其他实验设计方法相比，裂区实验设计通过主区将一个或多个作为副区的完全随机设计、随机区组设计、拉丁方设计等结合起来，可以适用于实验中有部分因子较难改变的情况，在医药领域常用于新型药物制剂的配方设计与优化[7-12]。在中药制药工艺研究中，在质量源于设计（qualitybydesign，QbD）理念的指导下合理应用裂区实验设计，有助于避免在研究过程中因为改变HTCF而导致后续研究中断或对后续研究造成干扰，同时帮助提高实验效率，减少不必要的资源浪费。响应曲面法（responsesurfacemethodology，RSM）是一种随机优化过程的统计学方法[13]，目前在中药生产过程工艺优化的研究中已经有了广泛的应用[14-15]，主要用于考察工艺参数间相互作用以及工艺参数的二次效应对工艺评价指标的影响。人工神经网络（artificialneuralnetwork，ANN）在过程建模、优化方面具有强大的信息提取能力，较RSM可以建立更加复杂关系的模型，尤其是非线性关系，是一种多项式回归建模的替代方法[13]。近年来，ANN在过程预测及工艺优化方面的应用越来越广泛，并常常表现出比RSM更好的预测能力[16-17]。丹参川芎嗪注射液（SalviaeMiltiorrhizaeandLigustrazineHydrochlorideInjection，SMLHI）是由丹参提取液和盐酸川芎嗪组成的复方制剂，临床主要用于治疗闭塞性脑血管疾病及其他缺血性心血管疾病[18-20]。本研究以SMLHI生产的首要环节丹参水提工艺为研究对象，通过风险分析与筛选设计确定丹参水提的关键工艺参数（criticalprocessparameter，CPP）。在此基础上，考虑到加热效率的调整难以随机进行，采用基于裂区的D-最优实验设计。同时，采用RSM和ANN两种建模方法处理实验设计数据，建立丹参水提工艺CPP和关键质量属性（criticalqualityattribute，CQA）之间的定量关系。最后，选择较优的模型用于指导实际生产，并通过多指标优化算法考察丹参提取液的综合质量，确定最佳操作条件。1仪器与试剂
1.1仪器
Cary60型紫外-可见分光光度计及Agilent型高效液相色谱仪，配四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、ChemStation工作站，安捷伦科技有限公司；XS、AB-N型电子分析天平、SevenMult型pH综合测试仪，梅特勒-托利多上海有限公司；SEF电子天平，奥豪斯仪器有限公司；Milli-Q超纯水机，美国Millipore公司；DHG-A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；ZCY-15B型数控超级恒温槽，宁波天恒仪器厂。1.2试剂
丹参药材由贵州拜特制药有限公司提供，经贵州拜特制药有限公司苟维工程师鉴定为正品丹参（植物基原为唇形科鼠尾草属植物丹参SalviamiltiorrhizaBunge的干燥根和根茎），药材中丹酚酸B含量由课题组根据《中国药典》年版方法[21]测定而得；对照品丹参素钠（批号，质量分数≥98%）、原儿茶醛（批号，质量分数≥98%）、紫草酸（批号，质量分数≥98%）、迷迭香酸（批号，质量分数≥98%）、丹酚酸B（批号，质量分数≥98%）、丹酚酸A（批号，质量分数≥98%）均购自上海融禾医药科技发展有限公司；苯酚（批号）购自美国阿拉丁工业公司；硫酸（批号）购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸为色谱纯，购自德国Merck公司；超纯水由超纯水系统（Milli-Q?Synthesis，美国Millipore公司）制得。2方法与结果
2.1丹参水提工艺操作流程
以筛选实验中心点实验条件为例，取事先拣选好的5cm长的特定丹参药材g，加mL水（pH7，pH值用盐酸和氢氧化钠调节）浸泡12h，期间开启数控恒温槽，将油预热至℃。浸泡完成后，油浴加热升温至沸腾，保温60min，倾出一提液。随后加入mL水溶液（pH7）进行二次提取，同样升温至沸腾后继续保温60min，倾出二提液，与一提液均匀混合，作为后续测试所需样本溶液。2.2工艺评价指标选择及分析方法
丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B以及丹酚酸A是目前丹参相关中药制剂中主要的可追溯质量标志物[22-23]，本研究选择这6个成分的提出率作为提取工艺效率的指征，作为工艺研究的关键质量属性（criticalqualityattribute，CQA）。此外，提取液中杂质成分的存在不利于提取液的后续纯化及精制。预实验结果表明，糖类成分是SMLHI原料丹参提取物中的主要杂质成分，占提取物总固含量的60%以上，其存在会显著影响产品黏度、渗透压等[14]。综上，本实验选择丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、总糖及总固体的提出率为评价指标。单个指标提出率计算方法如公式（1）。
提出率＝提取液中含量（浓度）×提取液质量（体积）/药材质量（1）
在本研究中，采用高效液相色谱与紫外检测器联用（HPLC-UV）法[18]测量样品中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B以及丹酚酸A6种成分的含量；根据《中国药典》[21]规定的苯酚-硫酸法测定提取液的总糖含量，药典规定的恒重法测定提取液的总固含量。
2.3数据处理
2.3.1筛选实验数据处理为满足对中药注射液的安全性与有效性的双重保证，采用加权多元线性回归系数法筛选对结果影响较大的参数[24]。该方法已在多项中药制药过程工艺研究中进行了实践，且被证明具有较好的应用价值[15-16,25-26]。在本实验中，考虑到酚酸类成分为丹参提取物中的主要活性成分，因此在筛选CPP时重点考虑各工艺参数对酚酸类成分的影响，以各酚酸类成分在标准提取液（本研究中，以实验设计矩阵的中心点作为标准提取液）中的含量作为权重，其与回归模型相关系数的乘积作为该指标调整后的相关系数（adjustedcorrelationcoefficient，ACC）。以同一工艺参数在各指标模型中ACC的绝对值之和综合评价该工艺参数对生产工艺影响的大小，进而筛选出对水提工艺影响较大的工艺参数，进行进一步的优化。
2.3.2优化实验数据处理本研究为了更好地建立CPP与CQA之间的关系，同时采用RSM和ANN两种建模方法，并选择较优的模型用于指导SMLHI的生产。
（1）基于RSM建立CPP和CQA之间定量模型：基于裂区的实验设计RSM模型以公式（2）表示，由常数项、一次项、二次项、交叉项、区组效应、副区误差和主区误差组成。
a0是常数，ai、aii与aij为回归系数，Y是水提工艺关键质量属性，Xi是CPP，βk是区组效应，εk是副区误差，ε是主区误差，模型方程中移入或移除特定项的P值设定为0.10
（2）基于径向基函数网络建立CPP和CQA之间定量模型：径向基函数网络（radialbasisfunctionnetwork，RBF）作为ANN的一种，是一种结构简单、收敛速度快、能够逼近任意非线性函数的网络，较多层感知器相比较，达到相同模型精度需要的参数更少，对小样本数据有较好的拟合效果[27-28]。本研究以各组的工艺条件作为输入向量，输入节点个数等于CPP的个数；隐含层中心点采用随机选取的方式进行，基函数选用高斯函数，如公式（3）所示；输出层为线性单元，与隐含层全连接，因此实际输出可以用公式（4）表示。径向基函数网络结构如图1所示。
X为输入向量（工艺参数），ui为基函数的中心，σ为基函数的标准差，win为权重系数
为了综合比较2种模型的性能，选择R2和预测平均相对偏差（meanrelativeerror，MRE）对2种建模方法进行比较分析。Yreal为关键质量属性测量值，Ypre为关键质量属性预测值
2.3.3基于满意度函数确定最佳操作条件在实际生产中，有效成分与杂质的控制往往较为矛盾，2类物质的提出规律总是呈现出较为一致的趋势[11,29]。为了在提取过程中尽可能多的提取出酚酸类成分，并尽可能减少杂质提出，从而降低产品后处理中分离与纯化的难度，提高产品的质量，本研究综合考量各CQA，进一步利用多指标算法确定最佳的操作条件。
满意度函数法是一种常用的综合多个优化目标的方法，它将各响应指标的预测值分别通过各自的满意度函数转化成该指标的满意度，再将多个满意度合并成一个总体满意度，以便对得到的总体满意度函数进行单目标优化[3,30]。总体满意度（d）的计算如公式（6）所示。为评价指标满意度，wn为权重
所有计算由MicrosoftOfficeExcel（美国Microsoft公司）、Design-expert8.0.7（美国Stat-Ease公司）和MatlabRb（美国MathWorks公司）软件完成。2.4CPP筛选
2.4.1基于Plackett-Burman（PB）设计的CPP筛选实验根据实际生产经验和文献调研[11,29]，挑选出6个待筛选的CPP：加热温度（x1）、浸泡时间（x2）、保温时间（x3）、饮片质量（x4，以药材中丹酚酸B含量表示）、药材规格（x5，药材切碎程度）和溶剂pH值（x6）。并进一步采用PB实验设计考察上述6个待筛选的CPP，根据SMLHI生产过程的实际工艺确定各参数的操作范围。各个参数的设定水平及筛选实验的具体工艺条件参数见表1。此外，溶剂倍量会显著影响提取效率，在相关研究中均被视作CPP。
2.4.2CPP筛选实验结果筛选实验样品溶液中各组分的含量测定结果见表2，各工艺指标相应的回归系数及权重系数见表3。由表3可知，6个酚酸模型的决定系数（R2）均大于0.，总固体与总糖模型的R2大于0.，各个指标的回归模型均能描述工艺参数对指标的大部分影响。
水提工艺各影响酚酸提取效率的潜在CPP（x1～x6）的原始及调整后回归系数绝对值之和分别为0.、0.、0.、2.、0.、0.与0.、0.、0.、7.、0.、0.。说明药材中丹酚酸B含量、加热温度和保温时间3个参数调整后的回归系数绝对值之和大于其他工艺参数，即这3个参数对水提工艺中各酚酸的提出率变化有较显著的影响。此外，据表3可知，药材规格可以显著影响总固体和总糖的提出率。由于药材中丹酚酸B的含量在实际生产中采购过程会予以控制，因此本研究不进一步进行考虑。综上，最终选择加热温度（x1）、保温时间（x3）、药材规格（x5）和溶剂倍量（x7）为需要优化指标。2.5CPP优化
2.5.1基于裂区的D-最优实验设计在丹参提取工艺的实际操作中，无论是小试、中试还是商业规模下的试验，对提取罐温度进行实时调整都会影响实验效率与温控精度：首先，加热器的实时加热效率及温度本身较难调整；同时，一旦对加热器的加热效率进行调整，如不经过一段较长的等待时间，后续实验的升温曲线也会随之发生变化。此外，这样的变更也会极大增加时间成本与经费成本。因此，本实验采用基于裂区的D-最优实验设计，将加热温度设为困难因子（hard-to-changefactor，HTCF），保温时间、药材规格和溶剂用量（以倍量表示）设为易于改变因子（easy-to-changefactor，ETCF），各工艺参数的水平设定与实验设计见表4。
2.5.2优化实验的CQA选择本研究基于SMLHI实际生产情况和《中国药典》要求，在优化实验中对CQA进行了适当的调整。药典规定，SMLHI中的主要药效成分为盐酸川芎嗪与丹参素。丹参药材中成分主要为丹酚酸B、丹参素等酚酸主要是由丹酚酸B经过一系列降解反应后产生[31-32]。因此，基于对丹酚酸B降解路径的分析，本实验将紫草酸、丹酚酸A及丹参素折算成相应丹酚酸B物质的量，以四者物质的量的总和视作酚酸提出量，以该指标来综合评价酚酸类成分的提取规律。此外，考虑到杂质成分含量差异会影响提取液的物性参数以及后续纯化工艺，因此，选取总酚酸纯度（总酚酸纯度＝酚酸提出量/总固体提出量）评价提取液质量。基于以上综合考虑，选择酚酸提出率、总酚酸纯度、迷迭香酸提出率、总糖提出率和总固体提出率作为优化工艺的CQA。
2.5.3优化实验结果优化实验结果见表4。
（1）RSM模型：根据表4，采用Design-Expert软件建立多指标优化模型，经显著性分析，得到模型的回归系数、R2及P值见表5。从表5可知，各CQA模型R2均大于0.75，调整R2均大于0.68，表明模型能解释绝大部分变异。其中，加热温度对各个指标影响都不显著，对比筛选实验结果，加热温度的不同主要影响的是酚酸类成分组成。可能原因是加热温度不同对丹酚酸B降解存在一定程度的影响。提取时间和溶剂倍量对各成分提出率的相关系数都为正值，说明随着提取时间和溶剂用量增加各成分提出率都能增大，但延长提取时间会降低总酚酸纯度。药材规格对各成分提出率的相关系数均为负值，说明药材粉碎程度越大，各成分越容易提取出。实验结果与提取传质规律相吻合，溶剂倍量的增大，可以提高药材内外浓度差，增加传质推动力；药材规格越大，即药材比表面积越小，传质阻力就越大[33]。
（2）RBF模型：BRF模型隐含层节点个数太少模型会欠拟合，而节点个数过多会造成过拟合，因此对隐含层节点数进行了优化。随机选取优化实验设计中28组作为校正集，7组作为验证集，各指标模型的R2和交叉验证均方根误差（rootmeansquareerrorofcrossvalidation，RMSECV）随节点个数的变化趋势如图2所示。
依据图2结果，最终选择酚酸提出率、迷迭香酸提出率、总糖提出率、总固提出率和总酚酸纯度RBF模型的隐含层节点个数依次为12、11、6、10、14，并用7组验证集实验对训练好的RBF模型进行外部验证，结果如表6所示。从表6中可以发现，单克药材中的酚酸提出率、迷迭香酸提出率、总糖提出率、总固体提出率RBF模型外部验证均方根误差（rootmeansquareerrorofprediction，RMSEP）依次为0.%、0.%、4.%、2.%，总酚酸纯度外部验证均方根误差为0.%，结果均较好，表明RBF可以较好的应用于丹参水提过程的设计建模分析，且具有良好的预测性能。2.5.4RSM和RBF模型比较本研究以R2和MRE为模型质量评价指标对2种模型进行比较分析。28组校正集的RSM和RBF模型预测值和实测值关系见图3，各指标模型的R2和预测MRE见表7。容易发现，除了总糖提出率模型R2较RSM模型较差以外，RBF模型性能均较优于RSM模型。因此，本研究在所建RBF模型的基础上进行后续多指标优化。
2.6基于满意度函数的最佳操作条件确定
根据生产情况和经验，设定酚酸提出率、迷迭香酸提出率、总酚酸纯度需要满足的最小值以及总糖提出率、总固提出率需要满足的最大值，并计算在操作范围内各指标能达到的最大值或最小值。在本研究中，为了保证产品药效活性，赋予有效成分较大权重。各指标设定的最值、权重、满意度计算公式见表8，在此基础上，计算RBF模型的SMLHI水提工艺最佳操作条件。具有最佳满意度的操作参数为加热温度℃，保温时间84min，药材规格11cm，溶剂倍量为10；满意度为0.。3讨论
本研究在QbD理念的指导下，系统地考察了SMLHI生产过程的丹参水提工艺。首先，通过PB实验设计及加权回归系数法筛选出了影响丹参水提的CPP。接着，为了提高实验效率与操作精度，采用基于裂区D-最优实验设计法进行了优化实验设计，并通过RSM、RBF2种建模方法建立了CPP和CQA间的定量关系，2种模型的考察结果均较好。与RSM模型相比，训练所得的BRF模型整体性能较优，表明即使在数据量较小、实验运行次数有限的情况下，ANN也能表现出较好的拟合和预测能力。但是，RSM模型较ANN模型能够更加直观的表达工艺参数对指标的影响。最后，本研究使用多指标优化算法综合考察了丹参提取液质量，并基于较优的ANN模型确定了SMLHI水提工艺最佳的生产条件。传统的中药制药过程工艺优化研究过程中，当工艺参数的改动受限或更改成本高昂时，为充分发掘因子间的交互作用，需要引入特定的研究方法。本研究在实验设计过程中利用了基于裂区设计的优化方法，有效避免研究工作中工艺参数的改动受限，通过该设计方法得到合理的实验方案，有助于在降低研究成本的同时仍能对过程实现精准优化。此外，本研究将实验设计与ANN、多指标优化算法相结合，更好的建立了SMLHI提取工艺CPP和CQA之间的关系，并确定了丹参水提液质量最优的生产条件。本研究能够帮助提高研究效率并降低研究成本，对不同试验规模下中药制药工艺的过程研究具有较大参考价值，为中药制药工艺的研究与二次开发提供了新的参考方法。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来源：赵芳，陈泽麒，李文竹，苟维，刘飞，张程益，瞿海斌．基于裂区的D-最优实验设计法优化丹参川芎嗪注射液水提工艺[J].中草药,,52(1):45-54.
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