摘要：目的利用聚多巴胺（PDA）为载体，构建丹参（SMRR）PDA纳米递药系统（PDA-SMRR），能够大剂量负载多种丹参水溶性成分，使其更好地发挥抗氧化应激作用。方法制备PDA-SMRR纳米粒，通过单因素实验考察并优化处方工艺；通过激光粒度分析仪和透射电子显微镜考察纳米粒的粒径、电位和形态；透析法分析载药量及累积释放率；提取并培养大鼠乳鼠心肌细胞；CCK-8实验考察PDA-SMRR的生物安全性并验证PDA-SMRR对氧化应激损伤的心肌细胞的保护作用。结果最优载药工艺为pH值为3.5，载药时间为12h，载药温度为室温，并成功制备PDA-SMRR；其形态规整、大小均匀，测得纳米粒粒径为（.2±4.5）nm，体外释放表明该递药系统释放SMRR较缓慢；CCK-8实验说明PDA-SMRR生物安全性良好且纳米粒可以降低氧化应激造成的心肌细胞损伤。结论PDA-SMRR可以作为丹参多成分药物储库，载药量高，具有缓释效应，可以有效减少氧化应激对心肌细胞的损伤。
多成分、多靶点是中药的固有特性，中药中的多种有效成分是发挥多靶点效应的物质基础。如何大剂量负载多种有效成分是制备中药新型制剂的关键科学问题。因此，有必要针对中药多成分复杂体系寻找一种新的载药策略。
海洋生物贻贝可以分泌出黏性蛋白多巴胺，其在碱性环境中可以氧化自聚，生成无定形并可以粘黏在材料表面的高分子聚合物聚多巴胺（PDA）[1-2]。PDA是一种具有良好的生物相容性的仿生材料[3-4]，具有活性氧（ROS）清除作用，已经被广泛应用于生物医药领域的研究[5-10]。研究表明，PDA可通过π-π堆积、静电力吸附、共价键作用等方式对多成分进行大剂量吸附[11-14]。课题组前期研究中已经验证PDA可同时吸附叶酸、阿霉素和咪喹莫特并具有较好的缓释效应[9]，推测PDA纳米粒可对中药多成分进行高效吸附。
丹参SalviaeMiltiorrhizaeRadixetRhizoma（SMRR）是唇形科丹参属植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，具有抗氧化应激[15,16]、扩张血管[17,18]、改善微循环[19-23]等作用。本实验将SMRR作为模型药物，通过PDA对SMRR中多种水溶性成分的吸附，构建多成分、高载药量的SMRR药物储库。
1仪器与材料
1.1仪器
BS-S电子天平，德国Sartorius公司；LC-AHT高效液相色谱仪，岛津实验器材有限公司；MicroCL离心机，美国Thermo公司；SynergyUV纯水仪，美国Millipore公司；超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；Malvern激光粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司；SynergyH1m酶标仪，美国BIOTEK公司；HJ-6磁力加热搅拌器，金坛区西城新瑞仪器厂；Labconco4.5L冷冻干燥机，美国LABCONCO公司；X-CiteSeriesQ倒置荧光显微镜，德国Zeiss公司。
1.2材料
丹参药材，购于上海华宇药业有限公司山东药源基地，批号，医院本部药剂科沈云士主管中药师鉴定，为唇形科丹参属植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎；盐酸多巴胺，美国Sigma-Aldrich公司；对照品丹酚酸B（批号-，质量分数＞98%）、迷迭香酸（批号-，质量分数＞98%）、咖啡酸（批号-，质量分数＞98%），购于中国食品药品检定研究院；对照品紫草酸（批号，质量分数＞98%），购自上海源叶生物科技有限公司；PBS，北京索莱宝科技有限公司；胎牛血清、DMEM培养基、胰酶、Brdu均购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；乙醇、甲醇、氨水、乙腈均为色谱纯，南京化学试剂有限公司；磷酸为分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；纯水，南京中医药大学自制。乳鼠心肌细胞，来源于出生24～72h的SD大鼠新生乳鼠，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场。
2方法与结果
2.1丹参水提液的制备
称取丹参药材g，加入mL纯水，煎煮40min，纱布滤过，得提取液1；将药渣加入mL纯水，重复煎煮40min，纱布滤过，得提取液2；将提取液1和提取液2合并，浓缩至mL，置于4℃冰箱，避光保存。
酚酸类成分是丹参水提液中的主要成分和药效成分，故选取咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B进行进一步分析。
2.2丹参水提液中4种成分含量测定方法的建立
2.2.1色谱条件采用Cromasil-S-C18色谱柱（mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～15min，10%～20%乙腈；15～35min，20%～25%乙腈；35～45min，25%～30%乙腈；45～55min，30%～90%乙腈；55～70min，90%乙腈；检测波长为nm；进样量为10μL；体积流量为1.0mL/min；柱温为30℃
2.2.2供试品溶液的制备取适量丹参水提液，10r/min离心10min，取上清过0.45μm滤膜，即得。
2.2.3对照品溶液的制备取咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B对照品适量，精密称定，分别置于10mL棕色量瓶中，加75%甲醇水溶液制成质量浓度分别为、、、μg/mL的对照品溶液，置于冰箱4℃避光保存。
2.2.4专属性考察取“2.2.2”项供试品溶液，取“2.2.3”项对照品溶液和稀释溶液（75%甲醇），过0.45μm微孔滤膜，进样，结果见图1。在建立的色谱条件下，相邻峰之间分离度均大于1.5，方法专属性良好。
2.2.5线性关系考察取“2.2.3”项对照品溶液，用75%甲醇水溶液稀释成系列质量浓度的对照品溶液，过0.45μm滤膜，进样，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程分别为咖啡酸Y＝3.×X－6.×，r＝1.，线性范围0.～.μg/mL；迷迭香酸Y＝1.×X＋3.×，r＝0.，线性范围0.～.μg/mL；紫草酸Y＝1.×X＋1.8×，r＝0.，线性范围0.～.μg/mL；丹酚酸BY＝1.×X－3.×，r＝1.，线性范围0.～.μg/mL；结果表明在定量范围内各成分呈良好的线性关系。
2.2.6精密度试验精密吸取“2.2.2”项下同一供试品溶液，连续进样6次，以各成分的峰面积值分别计算，咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B4种成分峰面积的RSD分别为0.31%、0.21%、0.34%、0.47%，表明仪器精密度良好。
2.2.7重复性试验按照“2.2.2”项方法配制供试品溶液，平行6份，进样，咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B4种成分质量浓度的RSD分别为1.13%、0.94%、0.78%、1.54%，表明本方法重复性良好。
2.2.8稳定性试验取同1份“2.2.2”项下供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h进行测定，咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B4种成分峰面积的RSD分别为0.78%、0.40%、0.97%、1.43%，表明供试品溶液中各成分在24h内基本稳定。
2.2.9加样回收率试验取已知4种指标成分含量的丹参水提液，精密加入咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B混合对照品适量，配成质量浓度为待测成分含量的50%、%、%的溶液，每个质量浓度平行3份，计算各成分的加样回收率和RSD。咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B4种成分的平均加样回收率分别为.32%、.41%、.94%、.16%，RSD分别为1.1%、1.95%、1.78%、2.35%，表明本方法回收率良好。
2.2.10样品测定按照“2.2.2”项方法配制供试品溶液3份，进样，测定峰面积，用外标法计算出丹参水提液中咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的质量浓度分别为0.、4.、3.、78.μg/mL。
2.3PDA及PDA-SMRR的合成和表征
2.3.1PDA的合成称取50mg盐酸多巴胺溶于10mL纯水中，加入4mL无水乙醇和μL氨水，搅拌24h，10r/min高速离心15min，弃上清，沉淀用纯水洗3次，得PDA纳米粒溶液[9]，将溶液置于?80℃预冻24h，再使用冷冻干燥机进行真空干燥。
2.3.2载药量的测定供试品溶液的制备方法同“2.2.2”项下。供试品溶液中各药物成分的含量按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，测定载药前后溶液中药量，如图2，并按公式分别计算各成分的载药量，载药量为1gPDA能够负载的药物质量（mg）。载药前后的HPLC图也表明PDA能够同时吸附丹参水提液中的多种成分。
载药量＝(药物的原始质量－上清中残留药物的质量)/PDA的质量
2.4PDA-SMRR的处方工艺考察
采用单因素实验考察溶液不同的pH值、搅拌时间和温度对PDA载药量的影响。
2.4.1载药pH值的考察取0.5mL丹参水提液加入9.5mL纯水，调节pH值至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，加入5mgPDA避光搅拌8h，10r/min高速离心15min，取上清，过0.45μm滤膜，按“2.2.1”项下色谱条件测定上清中残留药物的质量，按“2.3.2”项方法测得载药量，结果见图3。沉淀用纯水洗3次，得PDA-SMRR纳米粒。结果表明，PDA在pH3.5时载药量最高，咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的载药量分别为（31.03±1.94）、（.52±19.21）、（.79±24.33）、（.72±39.02）mg/g。
2.4.2载药时间的考察载药条件参考“2.4.1”项，在pH值为3.5的条件下，考察不同载药时间（2、4、6、8、12h）对载药量的影响，结果见图4。结果表明，各成分载药量呈现先增大后变化不明显的趋势。载药时间从1h上升到8h，载药量明显增加，而从8h上升到12h，载药量略微增加但变化不明显。
2.4.3载药温度的考察载药条件参考“2.4.1”项，在pH值为3.5的条件下，载药时间为12h，考察不同载药温度（10、20、40℃）对载药量的影响，结果见图5。结果表明，不同温度下载药量没有明显差异。
最终确定PDA-SMRR的载药pH值为3.5，载药时间为12h，载药温度为室温，该条件下咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的载药量分别为（33.21±1.69）、（.69±16.21）、（.87±21.34）、（.94±26.34）mg/g。
2.5PDA-SMRR体外释放行为考察
取5mLPDA-SMRR溶液放置于相对分子质量为～0的Spectra/Por透析袋，在pH7.4的PBS缓冲液中37℃恒温水浴透析3d，按预定时间（0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、5、12、24、48、72h）取释放介质，同时补加相同温度同体积的PBS缓冲液，每个样品平行3份。所取样品采用HPLC进行分析，计算累积释放量并绘制时间累积释放率曲线。结果见图6。PDA-SMRR中SMRR的释放较缓慢，PDA-SMRR中SMRR在72h内的累积释放率达75%左右，具有一定的缓释效应。说明PDA-SMRR具有较好的缓释效应。
2.6PDA-SMRR的表征
2.6.1粒径分布采用粒径测定仪比较PDA和PDA-SMRR粒径变化，结果见图7。PDA载药前平均粒径为（.8＋5.7）nm，载药后平均粒径为（.2±4.5）nm，粒径分布较窄。
2.6.2Zeta电位通过粒径分析仪测定PDA和PDA-SMRR的电位。结果在pH3.5的条件下，PDA的Zeta电位为（41.34±0.42）mV，载药后PDA-SMRR的Zeta电位为（3.01±0.3）mV；在pH7.4的条件下，PDA的Zeta电位为（?28.42±0.21）mV，载药后PDA-SMRR的Zeta电位为（?9.40±0.31）mV。
2.6.3形态观察取适量PDA-SMRR溶于超纯水中，制铜网样品，通过透射电镜TEM观察形态。如图8所示，PDA-SMRR为球形纳米结构。
2.7PDA-SMRR对H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤的影响
2.7.1大鼠乳鼠心肌细胞的提取心肌细胞来源于出生24～72h内的SD大鼠新生乳鼠。75%乙醇消*皮肤，剪开胸部皮肤，取出心脏，置于盛有pH7.4PBS（预冷，含双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5mL灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加2mL0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8min，静置沉淀1min，弃上清，再加2mL0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化5min；取上清，加入含有5mL10%胎牛血清的DMEM培养基的离心管中，剩余沉淀中加入2mL0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复以上的步骤4～5次，直至组织块消化完毕，置于培养箱2～3h待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管0r/min离心5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mmol/L），铺中皿培养。48h换液后可得心肌细胞。
通过显微镜观察发现，刚分离的心肌细胞未铺展开，呈球形，培养2h后心肌细胞贴壁生长，部分细胞伸出伪足成三角形或者多边形。有少许细胞开始自发性搏动，频率在40～60次/min。约48h后大部分心肌细胞伸出伪足，细胞间相互交织成网状，形成细胞簇或者形成单层细胞（图9），自发搏动趋向同步性，搏动频率在80～次/min。
2.7.2PDA-SMRR的细胞安全性考察在48孔板中，移入大鼠乳鼠心肌细胞（2×个/孔），加入DMEM培养基，每孔50μL，37℃、5%CO2条件下孵育24h后，弃去原培养液。取“2.4”中配制的PDA-SMRR，将负载的咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的总药量浓度作为心肌细胞安全性考察指标，用不含胎牛的DMEM培养基配制成不同质量浓度（1、5、10、20、50μg/mL）的PDA-SMRR作为给药组，以未加PDA-SMRR，直接加入不含胎牛的DMEM培养基作为对照组。
使用CCK-8试剂盒检测细胞活力，结果见图10。结果表明，PDA-SMRR作用于心肌细胞后，与对照组相比，给药组随着PDA-SMRR质量浓度的增加，心肌细胞存活率无明显变化，当质量浓度为50μg/mL时，心肌细胞出现明显活力降低。因此当丹参水提液中4个成分的质量浓度在1～20μg/mL时的PDA-SMRR生物安全性良好。
2.7.3H2O2诱导细胞氧化应激损伤模型的建立在48孔板中移入乳鼠心肌细胞（2×个/孔），加入DMEM培养基，每孔50μL，37℃、5%CO2条件下孵育24h后，弃去原培养液，将心肌细胞分为对照组和模型组。模型组加入不同浓度的（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/L）H2O2溶液，每个浓度设置6个孔，每孔加入μL，造成细胞的氧化损伤；对照组加入μLDMEM完全培养基，设置6个复孔。6h后，使用CCK-8试剂盒检测不同浓度的H2O2对心肌细胞的损伤程度，结果见图11。结果表明，H2O2作用于心肌细胞后，与对照组相比，模型组随着H2O2浓度的增加，心肌细胞存活率逐渐降低，呈现一定剂量依赖性，浓度为1.0μmol/L时细胞活力最低，0.4μmol/L对细胞造成的损伤比较适中，本实验选择H2O2浓度为0.4μmol/L进行后续实验。
2.7.4PDA-SMRR对H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤的影响在48孔板中移入大鼠乳鼠心肌细胞（2×个/孔），加入DMEM培养基，每孔50μL，37℃、5%CO2条件下孵育24h后，弃去原培养液，将心肌细胞分为对照组、模型组和给药组。弃去原培养液，给药组加入低剂量（5μg/mL）、中剂量（10μg/mL）、高剂量（20μg/mL）的PDA-SMRR以及相应浓度的丹参水提液，模型组、对照组分别加入不含胎牛的DMEM培养基，进行预处理，每个质量浓度设置6个复孔，每孔加μL，预处理4h；预处理后给药组和模型组加入H2O2溶液，使其终浓度为0.4μmol/L。
使用CCK-8试剂盒检测PDA-SMRR对H2O2诱导的心肌细胞氧化应激损伤的影响，结果见图12。结果表明，与对照组相比，模型组心肌细胞存活率明显降低，表明H2O2溶液造造模成功；给药组细胞存活率较模型组有明显改善，呈一定的剂量依赖性，剂量为20μg/mL的PDA-SMRR效果最佳，并且PDA-SMRR的药效优于SMRR，可能是由于PDA-SMRR释放负载药物后，PDA自身发挥一定的抗氧化应激作用。
2.8统计学处理
采用SPSS20.0分析软件进行统计分析，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。
3讨论
本实验利用PDA成功地对多种丹参水溶性成分进行了大剂量负载。考察PDA-SMRR处方制备工艺，发现载药环境pH值对载药量的影响较大，通过对pH值的改变来调控PDA的表面电位。当pH值小于4时，PDA表面带正电荷，载药后PDA-SMRR表面电荷趋于0mV，猜测其载药机制可能是静电力吸引为主。PDA在pH7.4的环境下发生电荷翻转，表面呈负电荷，促使吸附的药物释放，体外累积释放率表明，在pH为7.4的释放介质中，PDA-SMRR可以在72h内缓慢释放药物成分，但是由于吸附机制还存在π-π堆积、共价键等其他作用力，且不同成分的吸附机制不同，因此不同药物的释放速率也不同。
CCK-8实验显示，SMRR和PDA-SMRR均有抗氧化应激能力，且PDA-SMRR保护氧化应激造成的心肌细胞损伤的作用较SMRR明显。丹参水溶性成分以酚酸类化合物为主，具有抗氧化应激的作用[24-25]。PDA-SMRR增强抗氧化应激作用可能是由于PDA自身可以清除氧化应激诱导的活性氧（ROS）[26]。PDA与SMRR结合，提高载药量的同时增强了抗氧化作用，具有药辅合一的特性。
本研究发现，PDA作为一种新型载体，载药方式多样且可调控性强，可以大剂量负载多种成分，将其作为中药多成分的载体具有良好的应用前景。
参考文献（略）
来源：顾依，周琴，刘馨，刁和芳，陈志鹏，陈瑞，朱辰奇．丹参聚多巴胺纳米递药系统的构建及对H2O2诱导心肌细胞氧化损伤的保护作用研究[J].中草药,,51(14):-.
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