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基原、炮制、剂量等问题是制约经典名方中药复方制剂研发的第一道门槛。为此，中药大品种联盟，遴选相关文献，供研发者参考。
丹参煎煮化学成分溶出规律研究
李耿，于长安1，李振坤2，
唐仕欢2，廖文强1，杨洪*2通讯作者
（1.医院全国中西医结合心血管病中心，北京；2.中国中医科学院中药研究所，北京）
中药的疗效是由一系列化合物群（有效成分）的协调作用而体现的，在药材、饮片质量稳定的前提下，随着煎煮时间、溶剂用量、煎煮次数、药材粉碎粒度、煎煮溶剂极性、煎煮的温度和压力等因素变化，煎煮溶出的活性成分的含量及比例相应发生变化，从而影响临床用药效果。本研究采用析因试验设计，对丹参进行了多因素、多水平的交叉试验，较为全面的考察了其多种活性成分在煎煮过程中溶出和变化的规律，为合理用药提供科学依据。本文主要探讨了煎煮时间、水用量、煎煮次数3个因素对丹参主要有效成分影响(其它因素的影响另文讨论)。
1仪器和材料1.1仪器美国WATERS超高效液相色谱（UPLC）ACCURICY系统，包括二元超高压溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、二极管阵列检测器、Empowr2色谱工作站。
1.2试剂甲醇（色谱纯，美国Fishr），冰醋酸（分析纯，北京化工厂）；煎煮用水：蒸馏水；色谱用水：娃哈哈纯净水（市售瓶装）。
1.3对照品丹参素钠（批号－）、丹酚酸B（批号－）、原儿茶醛（批号－）、原儿茶酸（批号－）、丹参酮ⅡA（批号－）、隐丹参酮（批号－）对照品均购自中国药品生物制品检定所。
1.4饮片丹参饮片，购自北京同仁堂药店，产地为山东。
2方法与结果2.1试验设计
2.1.1加水倍数目前临床常规用药时，一般每剂药的最终煎出液体积约为～mL（2袋/剂，约～mL/袋）；药典规定丹参用量为9～15g，因此本研究设计重点考察加水倍数范围为10～40倍，采用固定用水量（mL），改变煎煮样品重量（6.25～25g）从而改变加水倍数的方式。
2.1.2煎煮时间为全面研究各成分煎煮过程中的变化规律，本试验分别考察了煎煮15，30，45，60，90min的情况。
2.1.3煎煮次数考察丹参2次煎煮仍有成分溶出，为全面考察各成分的溶出总量及变化规律，因此全部试验都进行了第3次的煎煮，第3次煎煮液的主要指标成分丹酚酸B含量增加很少，认为基本提取完全。
2.1.4析因试验设计析因试验设计又称为完全交叉分组试验设计，是一种多因素、多水平单效应的交叉分组试验，它可提供较多的信息，缩小随机误差，全面比较各因素水平间的效应。为全面考察煎煮过程中丹参各有效成分的含量变化规律，本研究结合实际临床用药情况，采用析因试验设计，进行了3个主要影响因素、多水平的全部交叉试验。各因素和水平如表1。
2.2试验方法
称取与上述各加水倍数相应重量的丹参饮片，加水mL，按上述各因素不同水平分别进行回流煎煮，煎出液过滤冷却，定容至mL，精密量取上述各次试验的煎出液1mL，用甲醇稀释定容至10mL，用0.2μm的滤膜过滤，取续滤液进样1μL。
2.3饮片中药典规定成分的含量测定
根据《中国药典》5版一部丹参项下测定该批丹参饮片中丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量，结果二者含量分别为8.%和0.%。
2.4饮片中其它成分的含量测定
2.4.1色谱条件色谱柱为ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱（2.1mm×50mm，1.7μm）；流动相：A相为1％甲酸溶液，B相为甲醇；色谱梯度（以B相的比例表示）为：0～2min8%，2～7min33％，7～9min％；流速：0.4mL·min-1；检测波长：nm；柱温：40℃；样品管理器温度：4℃；进样量：1μL，各成分均完全分离（见图1）。
2.4.2对照品溶液的制备精密称取丹参素钠、原儿茶醛、原儿茶酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、隐丹参酮对照品用甲醇溶解并定容，分别得到各自的对照品溶液（浓度分别为5.06、1.04、0.06、51.2、4.10、18.0μg·mL-1）。
2.4.3供试品溶液的制备取粉碎并过3号药典筛的丹参饮片粉约2g，精密称定，精密加入95％乙醇mL并称重，超声提取60min（功率W，频率25kHz）后，补足液体重，过0.2μm的滤膜，取续滤液进样。
2.4.4线性关系考察依次精密量取各对照品溶液0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00μL，分别进样，测定峰面积。分别以色谱峰面积积分值（Y）对其浓度（X）进行对照品标准曲线的回归方程见表2。
2.4.5方法学考察精密度试验：取供试品溶液连续进样6次，每次1μL，测定各成分峰面积积分值，RSD分别为：丹参素钠0.68％、原儿茶醛0.35%，结果表明仪器精密度良好；稳定性试验：取同上供试品溶液（保存于4℃冰箱内），分别在1、2、4、6、8d测定各成分峰面积积分值，测得各成分的RSD分别为：丹参素钠0.98％、原儿茶醛1.05%，结果表明,供试品溶液在4℃避光条件下8d内稳定；重复性试验：取同一批样品，平行取样5份，制备供试品溶液，测定计算各成分的含量，其RSD分别为：丹参素钠0.53％、原儿茶醛0.45%，结果表明重复性良好；回收率试验：同时在另3份样品中加入适量的丹参素钠、原儿茶醛、原儿茶酸对照品，同样操作；精密吸取丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸标准品储备液分别1mL、0.5mL、0.5mL加入到10g丹参粉末中,充分搅拌,混匀,水浴蒸干，精称此粉末同前测定3次，结果如下：
测得该批丹参饮片中丹参素、原儿茶醛含量仅分别为0.%和0.%，远远低于其在煎出液中的含量；原儿茶酸未检出（饮片含量0.%）。
参考《中国药典》5版一部丹参项下测定丹参中丹参酮ⅡA的方法，同时测定隐丹参酮，1倍对照品加入样测得回收率为99.5％，RSD为0.98％，说明此方法可准确溶出并测定丹参中的隐丹参酮；精密度试验：取供试品溶液连续进样6次，每次1μL，测定峰面积积分值，隐丹参酮的RSD为0.58％，结果表明仪器精密度良好；稳定性试验：取同上供试品溶液（保存于4℃冰箱内），按上述色谱条件，分别在1、2、4、6、8d测定峰面积积分值，测得隐丹参酮的RSD为0.98％，结果表明,供试品溶液在4℃避光条件下8d内稳定；重复性试验：取同一批样品，平行取样5份，制备供试品溶液，测定计算隐丹参酮的含量，RSD为0.53％。测得该批饮片中隐丹参酮含量为0.%。
3结果本研究拟测定各试验条件下丹参水煎出液中丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、隐丹参酮6种成分的含量，但在所有试验的水煎出液中，原儿茶酸均未测到；丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量都很少（最多的试验分别为0.%和0.%），均不足该批药材中该成分含量的2%，故本研究最终重点考察丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B3种成分的含量；在各试验煎出液中丹酚酸B的含量都非常高，基本在4.0%～8.5％范围内，而且其峰面积占总积分峰面积比例也高达60％以上，远高于所有其它成分的含量。
由图2可知，丹酚酸B在回流煎煮30min左右提取率达到峰值，之后提取率一直降低；而丹参素和原儿茶醛在煎煮15～90min范围，随着时间增加，煎出量持续增加。
第1次煎煮液中丹酚酸B的含量就占总含量50～95％左右（根据溶剂倍数和煎煮时间有所不同）；第2次煎煮液中丹酚酸B仍有10～20％，第3次煎煮液中丹酚酸B含量很少（一般都小于5%）。加水量在15倍以上（约相当于处方量24g以下），加水倍数增加，提取率变化不大；15倍以下时，提取率明显下降。
4讨论本研究所有试验的煎出液中丹参酮ⅡA和隐丹参酮含量都非常少，说明仅用水煮，无论如何变化煎煮条件，都很难使脂溶性成分有效溶出；近年的研究表明，丹参酮ⅡA具有一定的细胞*性，可使细胞壁剥离,并对人CYPA2活性有强的抑制作用,影响药物在体内的代谢；且传统中医药丹参往往入汤药应用，本研究证实，汤剂中丹参酮类成分极难溶出，因此认为丹参中的脂溶性丹参酮类成分与丹参传统的中医药疗效关联性不大，药典中丹参药材的丹参酮ⅡA含量规格需在进一步的质量评价、药理学和*理学研究基础上重新修订。
丹参酚酸类是丹参水煎液中的主要化学成分，且丹参酚酸类成分是目前已知抗氧化作用最强的天然化合物之一，具有强大的清除自由基和抗氧化的活性，文献说明其主要有较强的扩张冠脉血管、降血脂、降血液黏度、抗血小板凝集、防止动脉粥样硬化等方面作用，基本代表了中医传统丹参的常用功效；其中丹酚酸B含量远远高于其它成分，可以作为主要指标性成分；但另一方面，丹参酚酸类成分的化学结构组成相似，均为若干各丹参素与咖啡酸单元组合而来，相关研究也均证实，丹酚酸A、丹酚酸B等均有相似的活性，仅仅以丹酚酸B的含量评价相关药物质量，也会造成评价结果不够客观、合理，认为采用结合丹酚酸B的含量和丹参总酚酸含量（或总抗氧化活性）来控制丹参药材、饮片及以丹参水溶性成分入药的中成药质量较为合理；测定丹参酚酸类成分的含量或提取此类成分时，应尽量避免采用用长时间、高温煎煮的方式。
本研究结果表明，丹参药材中的丹参素和原儿茶醛含量本身非常少，而随着煎煮时间延长，丹酚酸B含量不断减少，同时丹参素和原儿茶醛含量持续增加；再结合其化学结构特点，丹酚酸A、B等结构中都含有若干丹参素单元，因此，认为丹参中的丹参素和原儿茶醛很可能主要是来源于丹参酚酸类成分在较高温度下的逐步降解。这也解释了为什么一些文献报道测定丹参中丹参素和原儿茶醛的含量时，回收率试验结果大多不甚理想，所测得的含量值经常相差数十倍，其实主要是由于采用了不同的煎煮提取方法，一般来说，煎煮时间越长所测得丹参素和原儿茶醛的含量值越高。
丹参酚酸类成分会随着煎煮时间延长而不断降解，因此临床丹参入药时不宜久煎（煎煮时间应控制在30min左右）；每剂最多煎煮两次即可；加水量15倍以下时，提取率明显下降，说明丹酚酸B在水中溶解度不是很大，临床应用时处方量过大（24g以上）或煎煮时加水过少，有可能导致有效成分溶出不完全。
版权声明：本文来源于《中国实验方剂学杂志》,9,15(8)。中药大品种联盟（BBTCML）获授权编校发布。编辑：远志。转载请标注作者及出处。
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